Luigi Ricciardi 1 , Rosa Mazzeo 2,*© , Angelo Raffaele Marcotrigiano 1 , Guglielmo Rainaldi 3 , Paolo Iovieno 4 , Vito Zonno 1 , Stefano Pavan 1© in Concetta Lotti 2,*
- 1 Oddelek za vede o tleh, rastlinah in hrani, Enota za rastlinsko genetiko in žlahtnjenje Univerze v Bariju, Via Amendola 165/A, 70125 Bari, Italija; luigi.ricciardi@uniba.it (LR);angelo.marcotrigiano@uniba.it (ROKA); vito.zonno@uniba.it (VZ); stefano.pavan@uniba.it (SP)
- 2 Oddelek za znanosti o kmetijstvu, prehrani in okolju, Univerza v Foggii, Via Napoli 25, 71122 Foggia, Italija
- 3 Oddelek za bioznanosti, biotehnologijo in biofarmacevtiko, Univerza v Bariju, Via Orabona 4, 70125 Bari, Italija; guglielmo.rainaldi@uniba.it
- 4 Oddelek za energetske tehnologije, Oddelek za bioenergijo, biorafinerije in zeleno kemijo, ENEA Trisaia Research Center, SS 106 Ionica, km 419+500, 75026 Rotondella (MT), Italija; paolo.iovieno@enea.it
* Korespondenca: rosa.mazzeo@unifg.it (RM); concetta.lotti@unifg.it (CL)
Povzetek:
Čebula (Allium cepa L.) je drugi najpomembnejši zelenjavni pridelek na svetu in je zelo cenjen zaradi svojih zdravstvenih koristi. Kljub velikemu gospodarskemu pomenu in vrednosti kot funkcionalne hrane je bila čebula slabo raziskana glede njene genetske raznolikosti. Tukaj smo raziskali genetsko variacijo pri »rdeči čebuli Acquaviva« (ARO), domači sorti s stoletno zgodovino gojenja v majhnem mestu v provinci Bari (Apulija, južna Italija). Nabor 11 mikrosatelitnih markerjev je bil uporabljen za raziskovanje genetske variacije v zbirki zarodne plazme, ki jo sestavlja 13 populacij ARO in tri običajne komercialne vrste. Analize genetske strukture s parametričnimi in neparametričnimi metodami so poudarile, da ARO predstavlja dobro opredeljen genski sklad, ki se jasno razlikuje od domačih sort Tropea in Montoro, s katerima se pogosto zamenjuje. Da bi zagotovili opis čebulic, ki se običajno uporabljajo za svežo porabo, sta bili ovrednoteni vsebnost topne trdne snovi in ostrina, kar je pokazalo večjo sladkost v ARO glede na obe zgoraj omenjeni domači sorti. Na splošno je ta študija koristna za prihodnjo valorizacijo ARO, ki bi jo lahko spodbujali z oznakami kakovosti, ki bi lahko prispevale k omejevanju komercialnih goljufij in izboljšanju dohodka malih lastnikov.
Predstavitev
Rod čebule obsega približno 750 vrst [1], med katerimi je ena najbolj razširjenih čebula (Allium cepa L., 2n = 2x =16). A. cepa ima dvoletni cikel in reproduktivno vedenje z zunanjim križanjem. Danes je čebula zaradi svetovne proizvodnje (97.9 Mt) druga najpomembnejša zelenjavna rastlina za paradižnikom [2]. Čebulne čebulice so že od nekdaj uporabljali kot hrano in v ljudski medicini. Dejansko so stari Egipčani že poročali o več terapevtskih formulah, ki so temeljile na uporabi česna in čebule v medicinskem papirusu iz leta 1550 pred našim štetjem, Codex Ebers [3].
To vsestransko uporabno in zdravo zelenjavo uživamo surovo, svežo ali predelano in z njo obogatimo okus mnogih jedi. Več nedavnih študij trdi, da uživanje čebule lahko zmanjša tveganje za bolezni srca in ožilja [4,5], debelost [6], sladkorno bolezen [7] in različne oblike raka [8–10]. Zdravstvene lastnosti čebule se pogosto pripisujejo visokim nivojem dveh razredov prehranskih spojin: flavonoidov in alk(en)il cistein sulfoksidov (ACSO). V prvi razred spadajo flavonoli in antociani. Kvercetin je glavni zaznavni flavonol, znan po svojih močnih antioksidativnih in protivnetnih lastnostih pri lovljenju prostih radikalov in vezavi ionov prehodnih kovin [11]; medtem ko antocianini nekaterim sortam čebule dajejo rdečo/vijolično barvo. Kar zadeva ACSO, je najbolj razširjen izoaliin [(+)-trans-S-1-propenil-L-cistein sulfoksid] [12], nehlapna in neproteinogena žveplova aminokislina, shranjena v celicah, ki je posredno odgovorna za ostro aromo in okus čebule [13]. Po poškodbi tkiva izoaliin razcepi encim aliinaza, da nastane vrsta hlapnih spojin (piruvat, amoniak, tiosulfonati in propanetijev S-oksid), ki povzročijo solzenje in povzročijo neprijeten vonj (ostrina). [14]. Ostrina čebule se pogosto meri kot količina piruvične kisline, ki nastane s hidrolizo, na gram sveže teže. [15,16].
V državah sredozemskega bazena, predlagana kot eno od sekundarnih središč raznolikosti a. sev [17,18]čebulice kažejo veliko variabilnost v obliki, velikosti, barvi, suhi snovi in ostrini [19-ena]. Poleg tega lahko gnojenje na osnovi žvepla, agronomske prakse, vrsta tal, podnebne razmere in genotip kultivarjev ali domačih sort vplivajo na kakovost čebulic s podelitvijo posebnih organoleptičnih in hranilnih vrednosti [23-ena]. V Italiji je kljub široki razpoložljivosti zarodne plazme čebule le nekaj sort čebule pogosto podvrženih znanstvenim študijam in ustrezno označenih [28,29].
Temeljita genetska in fenotipska karakterizacija agrobiotske raznovrstnosti je ključnega pomena za zagotovitev ustreznega ohranjanja rastlinskih genskih virov in spodbujanje uporabe specifičnih genotipov v vrednostni verigi. [30-ena]. Za preslikavo so pogosto izbrani označevalci preprostega ponavljanja zaporedja (SSR). [33-ena], prstni odtis DNK in diskriminacija sort [36-ena]in zanesljivo oceno genetske variabilnosti znotraj in med domačimi sortami [39-ena], saj so lokusno specifični, multialelni, kodominantno podedovani, visoko ponovljivi in primerni za avtomatsko genotipizacijo.
V tej študiji smo se osredotočili na apulijsko tradicionalno apulijsko rdečo čebulo, »rdečo čebulo Acquaviva« (ARO), ki jo gojijo po metodah ekološkega kmetovanja na majhnem območju mesta Acquaviva delle Fonti v provinci Bari. (Apulija, južna Italija). Čebulice te domače sorte so velike in sploščene ter rdeče obarvane in se večinoma uporabljajo v lokalnih receptih. Čeprav je ARO pridobil znak kakovosti »Slow Food Presidium«, bi lahko njegovo proizvodnjo dodatno spodbujali in zaščitili z znaki kakovosti Evropske unije, kot sta zaščitena geografska označba (ZGO) in zaščitena označba porekla (POD), saj bi lahko prispevali k omejitvi komercialne goljufije in izboljšanje dohodka malih lastnikov. Pri tem so bili uporabljeni molekularni markerji SSR kot močno orodje za oceno genetske variacije med populacijami ARO in za razlikovanje te domače sorte od drugih dveh južnoitalijanskih domačih sort rdeče čebule. Poleg tega smo ocenili ostrino in vsebnost topnih trdnih snovi, da bi ocenili okus ARO v povezavi s tržnim povpraševanjem.
Rezultati
Vzpostavitev zbirke germplazme rdeče čebule Acquaviva in morfološka karakterizacija
Za vzpostavitev zbirke germplazme ARO so uporabili semena 13 populacij ARO landrace, ki so jih podarili kmetje v okviru projekta BiodiverSO Apulia Region.
Morfološki deskriptorji, povezani s čebulnico, lupino in mesom, so bili zbrani na germplazmi ARO in treh domačih sortah čebule, od katerih dve pripadata domači sorti »Tropea red onion« (TRO), ena pa domači sorti »Montoro copper onion« (MCO) (slika 1). Vse čebulice ARO so bile ploščate in zanje je bila značilna rdeča zunanja kožica in meso z različnimi odtenki rdeče. Nasprotno pa je bilo meso čebulic TRO popolnoma rdeče, medtem ko je bilo meso čebulic MCO slabo pigmentirano (tabela S1). Biokemična analiza je omogočila oceno vsebnosti trdnih snovi in ostrine. Kot je navedeno v tabeli 1, srednje vrednosti vsebnosti trdnih snovi v čebulicah v populacijah ARO so bile 7.60 in so se gibale od 6.00 (ARO12) do 9.50° Brix (ARO11 in ARO13). Ta vrednost je bila višja od tiste, ocenjene za domače sorte TRO in MCO (4.25 oziroma 6.00° Brixa).
Tabela 1. Vsebnost trdnih snovi, topnih in pikantnosti, ocenjene v populacijah "Acquaviva Red Onion" (ARO), "Tropea Red Onion" (TRO) in "Montoro Copper Onion" (MCO) *.
KODA | Vsebnost topne trdne snovi (Brix) | Ostrina (pmolg-1 FW) | ||
Pomeni | CV y (%) | Pomeni | CV y (%) | |
ARO1 | 6.25 D * | 5.65 | 5.84 ab * | 23.78 |
ARO2 | 7.25 DC | 4.87 | 6.51 | 22.98 |
ARO3 | 7.50 BCD | 9.42 | 5.28 ab | 22.88 |
ARO4 | 7.50 BCD | 0.00 | 6.97 | 3.74 |
HOOP 5 | 7.50 BCD | 0.00 | 6.80 | 9.68 |
ARO6 | 6.25 D | 5.65 | 4.51 ab | 39.18 |
ARO7 | 7.25 DC | 4.87 | 5.25 ab | 15.44 |
ARO8 | 9.00 AB | 0.00 | 7.04 | 3.49 |
ARO9 | 8.25 ABC | 4.28 | 6.84 | 0.15 |
ARO10 | 7.00 DC | 0.00 | 5.94 ab | 6.57 |
ARO11 | 9.50 | 7.44 | 5.54 ab | 16.43 |
ARO12 | 6.00 D | 0.00 | 4.91 ab | 9.70 |
ARO13 | 9.50 | 7.44 | 6.63 | 24.93 |
MCO | 6.00 D | 0.00 | 4.18 ab | 2.66 |
TRO1 | E 4.25 | 8.31 | 2.80 b | 2.10 |
TRO2 | E 4.25 | 8.31 | 4.28 ab | 4.79 |
* Srednje vrednosti z enakimi velikimi ali malimi črkami se statistično ne razlikujejo pri 0.01P oziroma 0.05P (test SNK). y Koeficient variacije.
Srednja vrednost pikantnosti ARO, ocenjena z vsebnostjo piruvične kisline, je bila 6.00, v razponu od 4.51 pmol g-1 FW (ARO6) do 7.04 (ARO8). Ta vrednost je bila višja od tiste, ocenjene pri domačih sortah TRO in MCO (3.54 pmol g-1 FW in 4.18 pmol g-1 FW).
Polimorfizem SSR in genetski odnosi med akcesiji
V tej študiji je 11 od 37 testiranih kombinacij primerjev SSR zagotovilo polimorfizme z enim lokusom, tj. največ dva produkta pomnoževanja pri enem posamezniku. Na splošno je bilo pri 55 posameznikih odkritih 320 alelov s številom alelov na lokus od 2 (ACM147 in ACM 504) do 11 (ACM132) in povprečno vrednostjo 5 alelov (tabela 2). V posameznih populacijah se je število alelov (Na) gibalo od 1.94 (ACM147 in ACM504) do 5.38 (ACM132), efektivno število alelov (Ne) pa od 1.41 (ACM152) do 2.82 (ACM449). Neskladja med vrednostmi Na in Ne so bile posledica prisotnosti alelov z nizko frekvenco v populacijah in prevlade le nekaj alelov. Najvišja opažena vrednost heterozigotnosti (Ho) je bila poudarjena za ACM138 in ACM449 (0.62), medtem ko je bila najnižja povezana z ACM152 (0.25). Pričakovana heterozigotnost (He), ki ustreza teoretičnemu pričakovanju v panmiktični populaciji, je znašala od 0.37 (ACM504) do 0.61 (ACM132, ACM138 in ACM449). Wrightov indeks fiksacije (Fis) je prikazal vrednosti blizu nič (povprečje 0.05) za vse označevalce, kar kaže na podobne vrednosti med opazovanimi in pričakovanimi stopnjami heterozigotnosti, kot je pričakovano za vrste, ki se križajo. Učinkovitost posameznega označevalca SSR pri genetskem prstnem odtisu je bila ocenjena z indeksom vsebnosti polimorfnih informacij (PIC) s srednjo vrednostjo 0.48 in je znašala od 0.33 (ACM504) do 0.67 (ACM132). Drugi indeks učinkovitosti, Shannonov informacijski indeks (I), je pokazal povprečno vrednost 0.84, predpostavljene vrednosti pa so se gibale od 0.45 (ACM152) do 1.20 (ACM132).
Tabela 2. Značilnosti polimorfizma 11 markerjev SSR, ki se uporabljajo za oceno genetske raznolikosti v populacijah ARO, TRO in MCO. Skupno število alelov (Na), obseg velikosti pasu in indeks vsebnosti polimorfnih informacij (PIC) Glej skupni niz 320 posameznikov, genotipiziranih v tej študiji. Število alelov (Na), število učinkovitih alelov (Ne), opažena heterozigotnost (Ho), pričakovana heterozigotnost (He), fiksacijski indeks (F).is) in Shannonov informacijski indeks (I) se nanašata na povprečne vrednosti, izračunane iz 16 populacij, od katerih vsako sestavlja 20 posameznikov.
Locus. | Skupaj Na | Razpon velikosti (bp) | PIC | Pomeni | |||||
Na | Ne | Ho | He | I | Fis | ||||
ACM91 | 4 | 189-205 | 0.40 | 2.63 | 1.72 | 0.38 | 0.39 | 0.66 | 0.04 |
ACM101 | 4 | 229-241 | 0.52 | 2.94 | 2.37 | 0.53 | 0.56 | 0.92 | 0.06 |
ACM132 | 11 | 186-248 | 0.67 | 5.38 | 2.78 | 0.55 | 0.61 | 1.20 | 0.09 |
ACM138 | 5 | 242-272 | 0.66 | 3.69 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.09 | -0.02 |
ACM147 | 2 | 264-266 | 0.37 | 1.94 | 1.83 | 0.44 | 0.44 | 0.62 | -0.01 |
ACM152 | 4 | 228-244 | 0.25 | 2.38 | 1.41 | 0.25 | 0.27 | 0.45 | 0.07 |
ACM235 | 4 | 286-298 | 0.41 | 2.81 | 1.77 | 0.44 | 0.41 | 0.72 | -0.06 |
ACM446 | 6 | 108-120 | 0.56 | 3.50 | 2.48 | 0.49 | 0.58 | 1.01 | 0.16 |
ACM449 | 8 | 120-140 | 0.66 | 4.88 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.18 | -0.03 |
ACM463 | 5 | 202-210 | 0.47 | 3.38 | 1.95 | 0.46 | 0.48 | 0.83 | 0.05 |
ACM504 | 2 | 188-192 | 0.33 | 1.94 | 1.64 | 0.30 | 0.37 | 0.54 | 0.20 |
Pomeni | 5 | 0.48 | 3.22 | 2.15 | 0.46 | 0.48 | 0.84 | 0.05 |
Med populacijami so ARO3, ARO6, ARO8, ARO10, TRO1 in MCO pokazali visoko stopnjo genetske variacije (Ho > 0.5, 7), medtem ko je bila najmanjša raznolikost opažena v populaciji ARO0.27 (Ho = 2, XNUMX) (dodatna tabela SXNUMX). Na splošno so vsi pristopi prikazali Fis vrednosti blizu nič (Fis povprečna vrednost = 0.054), kot je bilo pričakovano v pogojih naključnega parjenja.
Analiza molekularne variance in genetske strukture
Hierarhično razdelitev genetskih variacij med in znotraj populacij je izračunala AMOVA. Rezultati so poudarili znaten delež genetskih variacij znotraj populacij (87 %). Razlike med populacijami, 13 %, so bile zelo pomembne (P < 0.001) (Tabela 3). Vrednosti po parih parametra Fpt, analognega indeksu fiksacije Wrightovega Fst, v razponu od 0.002 (ARO2/ARO10) do 0.468 (ARO7/TRO2), so bile pomembne (P <0.05), razen za devet parnih primerjav (dodatna tabela S3).
Tabela 3. Analiza molekularne variance 320 genotipov iz 16 populacij Allium cepa L.
vir | df | Vsota kvadratov | Ocena variance | Varianca (%) | Fpt | P |
Med populacijami | 15 | 458.63 | 1.16 | 13% | ||
Znotraj populacij | 304 | 2272.99 | 7.50 | 87% | 0.134 | 0.001 |
Skupaj za plačilo | 319 | 2731.62 | 8.66 |
Preiskava genetske strukture pri a. sev zbirka, genotipizirana v tej študiji, je bila izvedena s pomočjo analize združevanja v skupine na podlagi modela primesi, implementirane v programski opremi STRUCTURE. Metoda Evanno AK je predlagala razdelitev v dva grozda (K = 2) kot najbolj informativno za naše nabor podatkov,s the Naslednja najvišji peak pri K = 5 (dodatna slika S1). za K = 2, aKMopulations were assigned do oninf dva grozda z rnernbertoip koeficient (q) > 0.7. Kot pravi shown noter Slika 2a, je prva skupina (imenovana S1) vključevala MCO in vse populacije ARO, medtem ko je skupina S2 združevala dve populaciji TRO. Pri K = 5 zagotavlja globlji opis nabora podatkov (slika 2b), 75 % pristopov je bilo dodeljenih enemu od petih grozdov. Ločitev med ARO (S1) in TRO (S2) je bila potrjena, čeprav so bile nekatere populacije ARO pomešane (q <0.7) ali razvrščene ločeno v dveh novih skupinah S3 in S4 (ARO7 oziroma ARO12). Zanimivo je, da je komercialni tip MCO tvoril ločen grozd (S5), ločen od apulijske rdeče čebule.
Genetski odnosi med populacijami
Polimorfizem SSR je omogočil risanje dendrograma genetske raznolikosti, rezultati filogenetske analize pa so prikazani na sliki 3a. Tukaj je bila zbirka zarodne plazme razdeljena na pet skupin, ki so močno podprte z vrednostmi zagona. Populaciji ARO7 in ARO12 sta bili takoj ločeni od preostalih populacij in sta tvorili dve različni skupini. Tretji grozd je vključeval dve komercialni populaciji TRO, medtem ko je četrto vozlišče delilo MCO od enajstih populacij ARO. Genetsko razmerje med populacijami je bilo nadalje raziskano z analizo glavnih koordinat (PCoA) (slika 3b). Kot je bilo že poudarjeno, so bile populacije ARO tesno združene, razen za ARO12 in ARO7, ki sta se pojavili na izoliranih mestih v ploskvi PCoA. Dva TRO in populacije MCO sta bili razpršeni v spodnji desni plošči ploskve.
Slika 3. Genetska raznolikost med 16 a. sev populacije, označene v tej študiji na podlagi njihovega profila SSR. (a) UPGMA dendrogram genetske razdalje. Podporne vrednosti Bootstrap >50 so navedene nad ustreznimi vozlišči; (b) analiza glavnih komponent (PCoA). Grozd, obkrožen z rdečo, se popolnoma ujema s skupino, ustvarjeno s filogenetsko analizo in sestavljeno iz 11 pristopov ARO.
Razprava
V veliki količini kmetijske biotske raznovrstnosti, ki se tradicionalno goji v južni Italiji, domače sorte čebule predstavljajo nišne proizvode, ki jih je treba zaščititi pred tveganjem genetske erozije in grožnjo zamenjave s sodobnimi kultivarji. V okviru regionalnega projekta BiodiverSO, katerega cilj je zbiranje, karakterizacija, promocija in varovanje genskih virov regije Apulija, ki so močno povezani z lokalno dediščino, smo vzpostavili semensko zbirko 13 populacij ARO landrace. Poročali smo o prvi oceni variacije ARO v smislu polimorfizmov DNK in dveh biokemičnih parametrov, vsebnosti topne trdne snovi in piruvične kisline, povezanih z lastnostmi okusa in pomembnih za sprejemanje svežih nekuhanih izdelkov. Poleg tega so podatke o domači sorti ARO primerjali s tistimi, zbranimi o dveh drugih pigmentiranih domačih vrstah čebule, s katerima se je pogosto zmotila.
Biokemične analize so poudarile sladkost 13 populacij ARO, povezano z visoko vsebnostjo topne trdne snovi in srednjo ostrino, v skladu s smernicami industrije sladke čebule [31]. Čebulice ARO so bile slajše od čebulic TRO in MCO landrace in so pokazale nekoliko večjo ostrino. Vendar pa je sladkost čebule posledica ravnovesja med vsebnostjo sladkorja in ostrino, zato bi lahko bila ta karakterizacija koristna za podporo selekcije genotipov, ki imajo vrednost, ki jo kmetje običajno izvajajo le na podlagi morfologije.
Potrjeno je bilo, da so markerji SSR uporabno orodje za razlikovanje genotipov, čeprav so bili zbrani na ozkem območju rasti, kot je mesto Acquaviva delle Fonti. Izbrani označevalci so pokazali večje število alelov kot označevalci, o katerih so prej poročali [43] in [44], vendar nižje od markerjev, o katerih poroča [45]. Poleg tega je 50 % našega nabora markerjev pokazalo vrednosti indeksa PIC, večje od 0.5, kar se je izkazalo za primernega za razlikovanje populacij v zbirki, kot predlaga [46]. Ocena raznolikosti znotraj populacij je pokazala podobne vrednosti med Ho in He, kar je povzročilo nizek Fis vrednote. To je v skladu z naravo zunanjega križanja A. cepa, ki resno trpi za inbreeding depresijo [47]. Celoten Fis vrednost, izračunana za populacije čebule, obravnavane v tej študiji (0.054), je bila nižja od tiste, ki jo je prej poročal [45] (0.22) in skoraj enak tistemu, ki ga je našel [31] (0.08) in [48] (0.00), ki je ocenjeval genetsko raznolikost pri domačih sortah čebule iz severozahodne Španije oziroma Nigra. Pomembne stopnje heterozigotnosti v populacijah ARO krepijo idejo, da Apulija predstavlja središče raznolikosti za številne vrtnarske vrste [32, 42, 49-ena].
AMOVA je poudarila, da večina molekularnih variacij v zbirki, genotipizirani v tej študiji, leži znotraj populacij. Vendar pa je pomembna genetska diferenciacija med populacijami (FPT vrednosti) je razkrilo pojav genetske stratifikacije. Dejansko, čeprav so naši rezultati pokazali prisotnost genetske enotnosti v večini populacij ARO, ki tvorijo dobro definiran grozd, sta populaciji ARO7 in ARO12 pokazali jasno razločen genetski profil. Ta rezultat bi lahko bil posledica različnega izvora semen, ki sta jih uporabila kmeta, iz katerih so bile zbrane populacije. Poleg tega se lahko na podlagi dobljenih rezultatov domače sorte ARO na genetski ravni jasno razlikujejo od domačih sort TRO in MCO. V nedavni študiji, [29] ocenil genetsko raznolikost več italijanskih domačih sort čebule, vključno z »Acquaviva«, »Tropea« in »Montoro«. Čeprav so avtorji uporabili označevalce SNP za oceno genetske raznolikosti širše zbirke čebule, genotipizacija ni mogla ločiti "Acquaviva" od čebule "Tropea" in "Montoro". Verjetno je to odstopanje posledica ugotovljene nizke srednje vrednosti PIC (0.292), kar kaže na skromno splošno informativnost analiziranih lokusov, kot trdi [29]. Nadalje, da bi raziskali prisotnost podstrukture v njihovem italijanskem grozdu, bi bilo bolje analizirati italijanske genotipe ločeno od preostale zbirke. Verjetno bi to omogočilo vizualizacijo vzorca genetske raznolikosti, povezane z geografsko stratifikacijo ali lastnostmi v empirični selekciji.
Skratka, ta študija predstavlja izčrpno poročilo o domači sorti čebule, ki je povezana z lokalno kulturno dediščino in je gospodarskega pomena za kmete. Naši rezultati poudarjajo, da je z nekaj izjemami za ARO značilen dobro definiran genski sklad, ki si zasluži, da se ohrani pred tveganjem genetske erozije. Zato je bila vzpostavitev reprezentativne zbirke tega dragocenega vira genske pestrosti ključnega pomena. Nazadnje bi lahko bila genetska in fenotipska karakterizacija ARO koristna za pridobitev znakov kakovosti iz Evropske unije.
Materiali in metode
Zbiranje germplazme, rastlinski material in ekstrakcija DNK
Skupina 13 populacij ARO landrace je bila pridobljena v okviru projekta regije Apulija (BiodiverSO: https://www.biodiversitapuglia.it/), skozi vrsto misij, izvedenih v »Acquaviva delle Fonti«, majhnem apulijskem mestu v provinci Bari v Italiji. Mesta zbiranja vsakega pristopa so bila preslikana prek geografskega informacijskega sistema (GIS) in navedena v tabeli 4. Poleg tega sta bili v to študijo vključeni dve populaciji iz TRO landrace in ena populacija iz MCO landrace in uporabljeni kot reference. Ves rastlinski material je bil pridelan v enakih okoljskih pogojih na poskusni kmetiji »P Martucci« Univerze v Bariju (41° 1'22.08″ S, 16°54'25.95″ V), v zaščitni kletki, da bi se izognili navzkrižnemu opraševanju med populacije in zagotavljanje opraševanja znotraj populacije s pomočjo vetrnic (Lucilija Cezar). Za 16 populacij so bile značilne lastnosti, povezane z velikostjo in obliko čebulice ter barvo kože in mesa (tabela S1). Poleg tega smo z ročnim refraktometrom izvedli analizo vsebnosti trdnih snovi in izmerili ostrino v vzorcih čebulnega soka z dodatkom 2,4-dinitrofenil hidrazina (0.125 % v/v v 2N HCl) in ocenjevanje absorbance pri 420 nm, kot poroča [31]. Za ugotavljanje prisotnosti pomembnih razlik sta bila izvedena Duncanov test z več razponi in test SNK.
Tabela 4. Seznam populacij, zbranih in genotipiziranih v tej študiji. Za vsako populacijo je navedena identifikacijska koda, lokalno ime, GPS koordinata in genska banka, ki ohranja semena.
Koda | Ime | GPS koordinate | Genska banka y |
ARO1 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’21.708″ N 16°49’1.631” E | Di.SSPA |
ARO2 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’14.28″ N 16°48’56.879” E | Di.SSPA |
ARO3 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’11.304″ N 16°49’13.079” E | Di.SSPA |
ARO4 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’3.348″ N 16°40’27.011” E | Di.SSPA |
ARO5 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°51’59.76″ N 16°53’0.527” E | Di.SSPA |
ARO6 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°52’48.72″ N 16°49’43.247” E | Di.SSPA |
ARO7 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’13.47″ N 16°50’23.783” E | Di.SSPA |
ARO8 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’18.816″ N 16°49’33.888” E | Di.SSPA |
ARO9 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54"51.372" N 16°49"3.504" E | Di.SSPA |
ARO10 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°54’1.188″ N 16°49’24.311” E | Di.SSPA |
ARO11 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°52"49.8" N 16°49"48.575" E | Di.SSPA |
ARO12 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°52’38.892″ N 16°49’28.379” E | Di.SSPA |
ARO13 | Cipolla rossa di Acquaviva | 40°53’21.768″ N 16°49’29.711” E | Di.SSPA |
TRO1 | Cipolla rossa lunga di Tropea | - | Di.SSPA |
TRO2 | Cipolla rossa tonda di Tropea | - | Di.SSPA |
MCO | Cipolla ramata di Montoro | - | Di.SSPA |
y Di.SSPA, Oddelek za vede o tleh, rastlinah in hrani, Univerza v Bariju. |
Listni material 20 genotipov na populacijo je bil vzorčen in shranjen pri -80 °C do uporabe. Za vrste, bogate s polisaharidi, npr A. cepa, prvi koraki odstranjevanja polisaharida so bistveni za pridobitev DNK dobre kakovosti, zato so bila začetna izpiranja v pufru STE (0.25 M saharoza, 0.03 M Tris, 0.05 M EDTA) izvedena, kot je opisano v [52]. Celotno DNK smo ekstrahirali po metodi CTAB [53] in končno je bila preverjena kakovost in koncentracija s spektrofotometrom Nano Drop 2000 UV-vis (ThermoScientific, Waltham, MA, ZDA) in elektroforezo v 0.8 % agaroznem gelu.
Analiza SSR
16 kombinacij temeljnih premazov EST-SSR, ki jih je razvil [54] in predhodno testiran v študijah genetske raznovrstnosti [43] in [44] in 21 genomskih SSR [45-ena] so bili pregledani, da se oceni njihova primernost (dodatna tabela S4). Genotipizacija je bila izvedena z uporabo metode ekonomičnega fluorescenčnega označevanja, pri kateri je rep M13 dodan vsakemu prednjemu primerju SSR [56]. Mešanice PCR so bile pripravljene v 20 gL reakcije, ki je vsebovala: 50 ng celotne DNA, 0.2 mM mešanice dNTP, 1X reakcijskega pufra PCR, 0.8 U DreamTaq DNA polimeraze (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA), 0.16 gM reverznega primerja , 0.032 gM prednjega primerja, razširjenega z zaporedjem M13 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'), in 0.08 gM univerzalnega primerja M13, označenega s fluorescenčnimi barvili FAM ali NED (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Reakcije PCR so bile izvedene v termociklerju SimpliAmp (Applied Biosystems, CA, ZDA) pri naslednjih pogojih za večino parov primerjev: 94 °C 5 minut, 40 ciklov pri 94 °C 30 s, 58 °C 45 s in 72 °C 45 s ter končni raztezek pri 72 °C 5 min. Pri ACM446 in ACM449 je bil uporabljen PCR z dotikom z žarjenjem od 60 °C do 55 °C v 10 ciklih, 30 ciklov pri 55 °C, čemur je sledilo končno podaljšanje za 5 minut pri 72 °C. Produkte PCR smo naložili v ploščo s 96 vdolbinicami in zmešali s 14 gL Hi-Di Formamida (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA) in 0.5 gL GeneScan 500 ROX Size Standard (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA). Amplikoni so bili razrešeni s pomočjo stroja za kapilarno sekvenciranje ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA), kjer so bili aleli ocenjeni kot sodominantni in dodeljeni z uporabo programske opreme GeneMapper različice 3.7.
Programska oprema GenAlEx 6.5 [57] in Cervus 3.0.7 [58] so bili uporabljeni za oceno števila alelov (Na), števila učinkovitih alelov (Ne), opažene heterozigotnosti (Ho), pričakovane heterozigotnosti (He), vsebnosti polimorfnih informacij (PIC), Shannonovega informacijskega indeksa (I) in indeksa fiksacije (Fis ) za vsak lokus SSR.
Ocena genetske raznovrstnosti
Hierarhično delitev genetske variacije med in znotraj populacij čebule je ovrednotil GenAlEx 6.5 [57] z analizo molekularne variance (AMOVA) z zagonom 999 za testiranje pomembnosti. Poleg tega je bila programska oprema GenAlEx 6.5 uporabljena za oceno raznolikosti znotraj vsake populacije z izračunom povprečja Ho, He in Fis v vseh lokusih SSR.
Struktura prebivalstva je bila ugotovljena z algoritmom združevanja v gruče na podlagi Bayesovega modela, implementiranega v programski opremi STRUCTURE v.2.3.4 [59]. Nabor podatkov je bil izveden s številnimi hipotetičnimi grozdi (K), ki so segali od 1 do 10, pri čemer je bilo določenih deset neodvisnih nizov za vsako vrednost K. Za vsako izvedbo, da bi preverili skladnost rezultatov, je bilo izvedenih 100,000 začetnih obdobij izgorevanja in 100,000 iteracij Markovove verige Monte Carlo (MCMC) v okviru modela primesi in neodvisnih frekvenc alelov med populacijami. Najverjetnejša vrednost K je bila določena z uporabo metode AK, ki jo je opisal [60], v spletnem programu STRUKTURA HARVESTER [61]. Posamezna populacija je bila dodeljena določenemu grozdu, ko je bil njen koeficient pripadnosti (q-vrednost) višji od 0.7, sicer je veljala za mešano poreklo.
Analiza glavnih koordinat je bila izvedena, da bi vizualizirali vzorce genetskega razmerja med pristopi, ki jih je razkrila Neijeva matrika genetske razdalje (dodatna tabela S5). Na podlagi frekvenc alelov je bil izdelan dendrogram genetske razdalje z uporabo metode neobteženih parnih skupin z analizo aritmetičnega povprečja (UPGMA) v programski opremi POPTREEW [62]. Za oceno zaupanja v hierarhično združevanje v gruče je bil uporabljen zagonski postopek z nastavitvijo 100 ponovnega vzorčenja nabora podatkov. Končno programska oprema MEGA X [63] je bil uporabljen kot program za risanje dreves.
Dodatni materiali: Naslednje so na voljo na spletu http://www.mdpi.com/2223-7747/9/2/260/s1. Tabela S1: Morfološka karakterizacija čebulic ARO, MCO in TRO. Tabela S2: Indeksi heterozigotnosti in fiksacije, izračunani za domače sorte ARO ter domače vrste TRO in MCO. Tabela S3: Parne vrednosti parametra Fpt. Tabela S4: Seznam SSR, uporabljenih v študiji. Tabela S5. Parna populacijska matrika genetske razdalje Nei. Slika S1: Črtni grafikon vrednosti K, ki se spreminjajo z Evannovo Delta K.
Prispevki avtorjev: CL in LR sta zasnovala študijo in načrtovala eksperiment; CL in PI sta opravila analizo molekularnih markerjev; ARM in VZ sta opravila terenske poskuse; RM, SP, GR in CL so sodelovali pri analizi podatkov; RM in CL sta napisala rokopis. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.
Financiranje: To delo je financiral regionalni apulijski projekt »Biotska raznovrstnost apulijskih rastlinskih vrst«—Programma di Sviluppo Rurale per la Puglia 2014–2020. Misura 10—Sottomisura 10.2; štipendija CUP H92C15000270002, Italija.
Zahvala: Zahvala gre »Azienda Agricola Iannone Anna« in »Associazione produttori della vera cipolla rossa di Acquaviva« za zagotavljanje rastlinskih materialov, uporabljenih v poskusu.
Konflikti interesov: Avtorji ne izražajo navzkrižja interesov.
Reference
- 1. Stearn, WT Koliko vrst Allium je znanih? Kew mag. 1992, 9, 180-182. [CrossRef]
- 2. FAOSTAT. Statistična zbirka podatkov FAO. Na voljo na spletu: http://www.fao.org/2017 (dostopano 8. januarja 2019).
- 3. Block, E. Kemija česna in čebule. Sci. Am. 1985, 252, 114-119. [CrossRef]
- 4. Lee, B.; Jung, JH; Kim, HS Ocena rdeče čebule na antioksidativno aktivnost pri podganah. Food Chem. Toxicol. 2012, 50, 3912-3919. [CrossRef]
- 5. Lee, SM; Mesec, J.; Chung, JH; Cha, YJ; Shin, MJ Vpliv izvlečkov čebulne lupine, bogatih s kvercetinom, na arterijsko trombozo pri podganah. Food Chem. Toxicol. 2013, 57, 99-105. [CrossRef] [PubMed]
- 6. Jošinari, O.; Shiojima, Y.; Igarashi, K. Učinki ekstrakta čebule proti debelosti pri zucker diabetičnih maščobnih podganah. Hranila 2012, 4,1518-1526. [CrossRef]
- 7. Akaš, MSH; Rehman, K.; Chen, S. Začimbna rastlina Allium cepa: prehransko dopolnilo za zdravljenje sladkorne bolezni tipa 2. Prehrana 2014, 30, 1128-1137. [CrossRef] [PubMed]
- 8. Wang, Y.; Tian, WX; Ma, XF Inhibitorni učinki čebule (Allium cepa L.) ekstrakta na proliferacijo rakavih celic in adipocitov z zaviranjem sintaze maščobnih kislin. azijski pak. J. Rak Prej. 2012,13, 5573-5579. [CrossRef] [PubMed]
- 9. Lai, WW; Hsu, SC; Chueh, FS; Chen, YY; Yang, JS; Lin, JP; Lien, JC; Tsai, CH; Chung, JG. Kvercetin zavira migracijo in invazijo človeških oralnih rakavih celic SAS prek zaviranja signalnih poti NF-kappaB in matrične metaloproteinaze-2/-9. Anticancer Res. 2013, 33, 1941-1950. [PubMed]
- 10. Nicastro, HL; Ross, SA; Milner, JA Česen in čebula: njihove lastnosti za preprečevanje raka. Rak Prej. Res. 2015, 8,181-189. [CrossRef]
- 11. Forte, L.; Torricelli, P.; Boanini, E.; Gazzano, M.; Rubini, K.; Fini, M.; Bigi, A. Lastnosti antioksidantov in popravljanja kosti hidroksiapatita, funkcionaliziranega s kvercetinom: študija so-kulture osteoblastov-osteoklastov-endotelijskih celic in vitro. Acta Biomater. 2016, 32, 298-308. [CrossRef]
- 12. Yamazaki, Y.; Iwasaki, K.; Mikami, M.; Yagihashi, A. Porazdelitev enajstih prekurzorjev okusa, derivatov S-Alk (en) yl-L-cisteina, v sedmih zelenjavah Allium. Food Sci. Technol. Res. 2011, 17, 55-62. [CrossRef]
- 13. Block, E. Organosulfurna kemija rodu Allium – Posledice za organsko kemijo žvepla. Angew. Chem. Int. Ed. angl. 1992, 31, 1135-1178. [CrossRef]
- 14. Griffiths, G.; Trueman, L.; Crowther, T.; Thomas, B.; Smith, B. Čebula – globalna korist za zdravje. fitoter. Res. 2002,16, 603-615. [CrossRef]
- 15. Schwimmer, S.; Weston, WJ Encimski razvoj piruvične kisline v čebuli kot merilo pikantnosti. J. Agric. Kemična prehrana. 1961, 9, 301-304. [CrossRef]
- 16. Ketter, CAT; Randle, WM Ocena pikantnosti čebule. notri Preizkušeni študiji za laboratorijsko poučevanje; Karcher, SJ, ur.; Združenje za biološko laboratorijsko izobraževanje (ABLE): New York, NY, ZDA, 1998; Zvezek 19, str. 177-196.
- 17. Hanelt, P. Taksonomija, evolucija in zgodovina. notri Čebula in sorodne kulture, Vol. I. Botanika, fiziologija in genetika; Rabinowitch, HD, Brewster, JL, ur.; CRC Press: Boca Raton, FL, ZDA, 1990; strani 1-26.
- 18. Rabinovič, HD; Currah, L. Allium Crop Science: nedavni napredek; CABI Publishing: Wallingford, Združeno kraljestvo, 2002.
- 19. Mallor, C.; Carravedo, M.; Estopanan, G.; Mallor, F. Karakterizacija genskih virov čebule (Allium cepa L.) iz španskega sekundarnega središča raznolikosti. Razpon. J. Agric. Res. 2011, 9, 144-155. [CrossRef]
- 20. Ferioli, F.; D'Antuono, LF Vrednotenje fenolov in cistein sulfoksidov v lokalni zarodni plazmi čebule in šalotke iz Italije in Ukrajine. Genet. Resour. Crop Evol. 2016, 63, 601-614. [CrossRef]
- 21. Petropoulos, SA; Fernandes, A.; Barros, L.; Ferreira, ICFR; Ntatsi, G. Morfološki, prehranski in kemijski opis "vatikiotiko", lokalne lokalne sorte čebule iz Grčije. Food Chem. 2015,182, 156-163. [CrossRef]
- 22. Liguori, L.; Adiletta, G.; Nazzaro, F.; Fratianni, F.; Di Matteo, M.; Albanese, D. Biokemične, antioksidativne lastnosti in protimikrobna aktivnost različnih sort čebule v sredozemskem območju. J. Food Meas. Znak. 2019,13, 1232-1241. [CrossRef]
- 23. Yoo, KS; Pike, L.; Crosby, K.; Jones, R.; Leskovar, D. Razlike v pikantnosti čebule glede na sorte, rastno okolje in velikost čebulic. Sci. Hortic. 2006,110, 144-149. [CrossRef]
- 24. Beesk, N.; Perner, H.; Schwarz, D.; George, E.; Kroh, LW; Rohn, S. Porazdelitev kvercetin-3, 4′-O-diglukozida, kvercetin-4′-O-monoglukozida in kvercetina v različnih delih čebule čebule (Allium cepa L.), na katere vpliva genotip. Food Chem. 2010,122, 566-571. [CrossRef]
- 25. Caruso, G.; Conti, S.; Villari, G.; Borrelli, C.; Melchionna, G.; Minutolo, M.; Russo, G.; Amalfitano, C. Učinki časa presajanja in gostote rastlin na pridelek, kakovost in vsebnost antioksidantov čebule (Allium cepa L.) v južni Italiji. Sci. Hortic. 2014,166, 111-120. [CrossRef]
- 26. Perez-Gregorio, MR; Regueiro, J.; Simal-Gandara, J.; Rodrigues, AS; Almeida, DPF Povečanje dodane vrednosti čebule kot vira antioksidantnih flavonoidov: kritični pregled. Crit. Rev. Nutr. 2014, 54,1050-1062. [CrossRef] [PubMed]
- 27. Pohnl, T.; Schweiggert, RM; Carle, R. Vpliv metode gojenja in izbire sorte na topne ogljikove hidrate in ostre principe v čebuli (Allium cepa L.). J. Agric. Kemična prehrana. 2018, 66, 12827-12835. [CrossRef] [PubMed]
- 28. Tedesco, I.; Carbone, V.; Spagnuolo, C.; Minasi, P.; Russo, GL Identifikacija in kvantifikacija flavonoidov iz dveh južnoitalijanskih kultivarjev Allium cepa L., Tropea (rdeča čebula) in Montoro (bakrena čebula), in njihova sposobnost zaščite človeških eritrocitov pred oksidativnim stresom. J. Agric. Kemična prehrana. 2015, 63, 5229-5238. [CrossRef]
- 29. Villano, C.; Esposito, S.; Carucci, F.; Frusciante, L.; Karputo, D.; Aversano, R. Visoko zmogljiva genotipizacija v čebuli razkriva strukturo genetske raznolikosti in informativne SNP-je, uporabne za molekularno vzrejo. Mol. Pasma. 2019, 39, 5. [CrossRef]
- 30. Mercati, F.; Longo, C.; Poma, D.; Araniti, F.; Lupini, A.; Mammano, MM; Fiore, MC; Abenavoli, MR; Sunseri, F Genetska različica italijanskega paradižnika z dolgo življenjsko dobo (Solanum lycopersicum L.) zbiranje z uporabo SSR in morfoloških lastnosti plodov. Genet. Resour. Crop Evol. 2014, 62, 721-732. [CrossRef]
- 31. Gonzalez-Perez, S.; Mallor, C.; Garces-Claver, A.; Merino, F.; Taboada, A.; Rivera, A.; Pomar, F.; Perovič, D.; Silvar, C. Raziskovanje genetske raznolikosti in kakovostnih lastnosti v zbirki čebule (Allium cepa L.) domače sorte iz severozahodne Španije. Genetika 2015, 47, 885-900. [CrossRef]
- 32. Lotti, C.; Iovieno, P.; Centomani, I.; Marcotrigiano, AR; Fanelli, V.; Mimiola, G.; Summo, C.; Pavan, S.; Ricciardi, L. Genetska, bioagronomska in prehranska karakterizacija ohrovta (Brassica oleracea L. var. acefala) raznolikost v Apuliji, južna Italija. raznolikost 2018,10, 25. [CrossRef]
- 33. Bardaro, N.; Marcotrigiano, AR; Bracuto, V.; Mazzeo, R.; Ricciardi, F.; Lotti, C.; Pavan, S.; Ricciardi, L. Genetska analiza odpornosti na Orobanche crenata (Forsk.) v grahu (Pisum sativum L.) linija z nizko vsebnostjo strigolaktona. J. Plant Pathol. 2016, 98, 671-675.
- 34. Wako, T.; Tsukazaki, H.; Yaguchi, S.; Yamashita, K.; Ito, S.; Shigyo, M. Kartiranje lokusov kvantitativnih lastnosti za čas vijačenja pri združevanju čebule (Allium fistulosum L.). Euphytica 2016, 209, 537-546. [CrossRef]
- 35. Dhaka, N.; Mukhopadhyay, A.; Paritoš, K.; Gupta, V.; Pental, D.; Pradhan, AK Identifikacija genskih SSR in izdelava zemljevida povezav na osnovi SSR v Brassica juncea. Euphytica 2017, 213, 15. [CrossRef]
- 36. Anandhan, S.; Mote, SR; Gopal, J. Vrednotenje sortne identitete čebule z uporabo označevalcev SSR. Seed Sci. Technol. 2014, 42, 279-285. [CrossRef]
- 37. Mitrova, K.; Svoboda, P.; Ovesna, J. Izbor in validacija nabora označevalcev za diferenciacijo sort čebule iz Češke republike. Čeh J. Genet. Rastlinska pasma. 2015, 51, 62-67. [CrossRef]
- 38. Di Rienzo, V.; Miazzi, MM; Fanelli, V.; Sabetta, W.; Montemurro, C. Ohranjanje in karakterizacija biotske raznovrstnosti zarodne plazme apulijske oljke. Acta Hortic. 2018,1199,1-6. [CrossRef]
- 39. Mallor, C.; Arnedo-Andres, A.; Garces-Claver, A. Ocenjevanje genetske raznolikosti španščine Allium cepa domače sorte za gojenje čebule z uporabo mikrosatelitskih označevalcev. Sci. Hortic. 2014,170, 24-31. [CrossRef]
- 40. Rivera, A.; Mallor, C.; Garces-Claver, A.; Garcia-Ulloa, A.; Pomar, F.; Silvar, C. Ocenjevanje genetske raznolikosti čebule (Allium cepa L.) domače sorte iz severozahodne Španije in primerjava z evropsko variabilnostjo. NZJ Crop Hortic. 2016, 44, 103-120. [CrossRef]
- 41. De Giovanni, C.; Pavan, S.; Taranto, F.; Di Rienzo, V.; Miazzi, MM; Marcotrigiano, AR; Mangini, G.; Montemurro, C.; Ricciardi, L.; Lotti, C. Genetska variacija globalne zbirke germplazme čičerike (Cicer arietinum L.), vključno z italijanskimi pristopi, ki jim grozi genska erozija. Physiol. Mol. Biol. Rastline 2017, 23, 197-205. [CrossRef]
- 42. Mazzeo, R.; Morgese, A.; Sonnante, G.; Zuluaga, DL; Pavan, S.; Ricciardi, L.; Lotti, C. Genetska raznolikost brokolija (Brassica rapa L. subsp. sylvestris (L.) Janch.) iz južne Italije. Sci. Hortic. 2019, 253, 140-146. [CrossRef]
- 43. Jakše, M.; Martin, W.; McCallum, J.; Havey, M. Polimorfizmi enega nukleotida, indeli in enostavne ponovitve zaporedja za identifikacijo sorte čebule. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 2005,130, 912-917. [CrossRef]
- 44. McCallum, J.; Thomson, S.; Pither-Joyce, M.; Kenel, F. Analiza genetske raznovrstnosti in razvoj markerjev polimorfizma z enim nukleotidom v gojeni čebuli na podlagi izraženih oznak zaporedja - enostavnih markerjev za ponavljanje zaporedja. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 2008,133, 810-818. [CrossRef]
- 45. Baldwin, S.; Pither-Joyce, M.; Wright, K.; Chen, L.; McCallum, J. Razvoj robustnih genomskih enostavnih zaporednih ponavljajočih se označevalcev za oceno genetske raznolikosti znotraj in med čebulo (Allium cepa L.) populacije. Mol. Pasma. 2012, 30, 1401-1411. [CrossRef]
- 46. DeWoody, JA; Honeycutt, RL; Skow, LC Mikrosatelitski markerji pri belorepih jelenih. J. Hered. 1995, 86, 317-319. [CrossRef] [PubMed]
- 47. Khodadadi, M.; Hassanpanah, D. Iranska čebula (Allium cepa L.) odzivi kultivarjev na depresijo v sorodstvu. Svetovna aplikacija Sci. J. 2010,11, 426-428.
- 48. Abdou, R.; Bakasso, Y.; Saadou, M.; Baudoin, JP; Hardy, OJ Genetska raznolikost nigerske čebule (Allium cepa L.), ocenjeno s preprostimi označevalci ponovitve zaporedja (SSR). Acta Hortic. 2016,1143, 77-90. [CrossRef]
- 49. Pavan, S.; Lotti, C.; Marcotrigiano, AR; Mazzeo, R.; Bardaro, N.; Bracuto, V.; Ricciardi, F.; Taranto, F.; D'Agostino, N.; Schiavulli, A.; et al. Razločen genetski grozd v gojeni čičeriki, kot ga je razkrilo odkritje in genotipizacija markerjev v celotnem genomu. Rastlinski genom 2017, 2017,10. [CrossRef]
- 50. Pavan, S.; Marcotrigiano, AR; Ciani, E.; Mazzeo, R.; Zonno, V.; Ruggieri, V.; Lotti, C.; Ricciardi, L. Genotipizacija s sekvenciranjem melone (Cucumis melo L.) Zbirka zarodne plazme iz sekundarnega središča raznolikosti poudarja vzorce genetske variacije in genomske značilnosti različnih genskih skladov. BMC Genom. 2017, 18, 59. [CrossRef]
- 51. Di Rienzo, V.; Sion, S.; Taranto, F.; D'Agostino, N.; Montemurro, C.; Fanelli, V.; Sabetta, W.; Boucheffa, S.; Tamendžari, A.; Pasqualone, A.; et al. Genetski tok med populacijo oljk v sredozemskem bazenu. Peer J. 2018, 6. [CrossRef]
- 52. Pastir, LD; McLay, TG Dva protokola na mikro merilu za izolacijo DNK iz rastlinskega tkiva, bogatega s polisaharidi. J. Plant Res. 2011,124, 311-314. [CrossRef]
- 53. Doyle, JJ; Doyle, JL Izolacija rastlinske DNK iz svežega tkiva. Osredotočite 1990,12, 13-14.
- 54. Kuhl, JC; Cheung, F.; Qiaoping, Y.; Martin, W.; Zewdie, Y.; McCallum, J.; Catanach, A.; Rutherford, P.; Pomivalno korito, KC; Jenderek, M.; et al. Edinstven nabor 11,008 čebulno izraženih zaporednih oznak razkriva izraženo zaporedje in genomske razlike med vrstama enokaličnic asparagales in poales. Rastlinska celica 2004,16, 114-125. [CrossRef]
- 55. Kim, HJ; Lee, HR; Hyun, JY; Pesem, KH; Kim, KH; Kim, JE; Hur, CG; Harn, CH Razvoj markerjev za testiranje genetske čistosti čebule z uporabo SSR Finderja. Korejska pasma J. Sci. 2012, 44, 421-432. [CrossRef]
- 56. Schuelke, M. Ekonomična metoda za fluorescentno označevanje fragmentov PCR. Nat. Biotehnol. 2000, 18, 233-234. [CrossRef] [PubMed]
- 57. Peakall, R.; Smouse, PE GenAlEx 6.5: Genetska analiza v Excelu. Programska oprema za populacijsko genetiko za poučevanje in raziskovanje: posodobitev. bioinformatika 2012, 28, 2537-2539. [CrossRef] [PubMed]
- 58. Kalinowski, ST; Taper, ML; Marshall, TC Revizija, kako računalniški program CERVUS prilagodi napako pri genotipizaciji, poveča uspeh pri določanju očetovstva. Mol. Ecol. 2007,16, 1099-1106. [CrossRef]
- 59. Pritchard, JK; Stephens, M.; Rosenberg, NA; Donnelly, P. Kartiranje asociacij v strukturiranih populacijah. Am. J. Hum. Genet. 2000, 67, 170-181. [CrossRef]
- 60. Evanno, G.; Regnaut, S.; Goudet, J. Odkrivanje števila skupin posameznikov z uporabo programske opreme STRUKTURA: simulacijska študija. Mol. Ecol. 2005,14, 2611-2620. [CrossRef]
- 61. Earl, D.; VonHoldt, B. STRUCTURE HARVESTER: Spletna stran in program za vizualizacijo STRUCTURE rezultatov in izvajanje metode Evanno. Ohranjanje Genet. Resour. 2011, 4. [CrossRef]
- 62. Takezaki, N.; Nei, M.; Tamura, K. POPTREEW: Spletna različica POPTREE za izdelavo populacijskih dreves iz podatkov o frekvenci alelov in računanje nekaterih drugih količin. Mol. Biol. Evol. 2014, 31, 1622-1624. [CrossRef]
- 63. Kumar, S.; Stecher, G.; Li, M.; Knez, C.; Tamura, K. MEGA X. Analiza molekularne evolucijske genetike na različnih računalniških platformah. Mol. Biol. Evol. 2018, 35, 1547-1549. [CrossRef]